Expressão Recombinante do Peptídeo Antimicrobiano e Quelante de Cobre Microplusina, Contendo Modificações em suas Extremidades Amino- e Carboxi-terminais

Expressão Recombinante do Peptídeo Antimicrobiano e Quelante de Cobre Microplusina, Contendo Modificações em suas Extremidades Amino- e Carboxi-terminais

Araujo, Iris de; Lima, Júlia; Sperança, Marcia Aparecida; Puzer, Luciano; Daffre, Sirlei; Pires, Jose Ricardo Murari; Silva, Fernanda Dias da

Resumo:

A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre e ferro ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos. Também possui atividade pró-inflamatória contra macrófagos murinos. Estudos indicam que sua atividade antimicrobiana está relacionada à remoção do cobre do meio de cultura e que a depleção deste metal pode afetar importantes enzimas cobre-dependentes do metabolismo microbiano. Sua sequência primária é rica em histidinas, que junto com outros resíduos de aminoácidos, podem estar envolvidos na formação de seu sítio quelante de cobre. Estudos sobre a relação entre estrutura e atividade da microplusina tornam-se essenciais, a fim de se explorar o seu potencial terapêutico. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar a expressão recombinante de uma variante da microplusina, contendo remoção de aminoácidos, incluindo as histidinas presentes nas suas regiões amino- e carboxi-terminais. O gene da variante da microplusina foi inserido no vetor de expressão pRSET A, utilizando-se as enzimas de restrição BamHI e EcoRI. A expressão foi realizada através da transformação de bactérias E. coli BL-21 com o plasmídeo recombinante, utilizando-se IPTG (0,8 mM) como agente indutor. Foram avaliados três protocolos (P1: Expressão em E. coli BL-21 DE3, a 37°C, densidade celular inicial (DO600) entre 0,4 - 0,6 e 5 horas de indução; P2: E. coli BL-21 DE3, DO600 ~1, a 24°C, 16 horas de indução; P3: similar a P1, porém utilizando-se E.coli BL-21 (DE3) pLysS). A expressão da molécula foi avaliada por SDS-PAGE 16%. Entre os três protocolos testados, P1 foi o que apresentou expressão mais satisfatória do peptídeo e sua expressão foi detectada nas frações solúvel e insolúvel. Quanto a P2 e P3, não foi observada melhora no padrão de expressão. P1 apresentou-se como o melhor protocolo para expressão da variante da microplusina e será adotado para os próximos experimentos.

A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre e ferro ativo contra bactérias Gram-positivas e fungos. Também possui atividade pró-inflamatória contra macrófagos murinos. Estudos indicam que sua atividade antimicrobiana está relacionada à remoção do cobre do meio de cultura e que a depleção deste metal pode afetar importantes enzimas cobre-dependentes do metabolismo microbiano. Sua sequência primária é rica em histidinas, que junto com outros resíduos de aminoácidos, podem estar envolvidos na formação de seu sítio quelante de cobre. Estudos sobre a relação entre estrutura e atividade da microplusina tornam-se essenciais, a fim de se explorar o seu potencial terapêutico. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar a expressão recombinante de uma variante da microplusina, contendo remoção de aminoácidos, incluindo as histidinas presentes nas suas regiões amino- e carboxi-terminais. O gene da variante da microplusina foi inserido no vetor de expressão pRSET A, utilizando-se as enzimas de restrição BamHI e EcoRI. A expressão foi realizada através da transformação de bactérias E. coli BL-21 com o plasmídeo recombinante, utilizando-se IPTG (0,8 mM) como agente indutor. Foram avaliados três protocolos (P1: Expressão em E. coli BL-21 DE3, a 37°C, densidade celular inicial (DO600) entre 0,4 - 0,6 e 5 horas de indução; P2: E. coli BL-21 DE3, DO600 ~1, a 24°C, 16 horas de indução; P3: similar a P1, porém utilizando-se E.coli BL-21 (DE3) pLysS). A expressão da molécula foi avaliada por SDS-PAGE 16%. Entre os três protocolos testados, P1 foi o que apresentou expressão mais satisfatória do peptídeo e sua expressão foi detectada nas frações solúvel e insolúvel. Quanto a P2 e P3, não foi observada melhora no padrão de expressão. P1 apresentou-se como o melhor protocolo para expressão da variante da microplusina e será adotado para os próximos experimentos.

Palavras-chave:

DOI: 10.5151/biochem-vsimbbtec-21974

Referências bibliográficas

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Como citar:

Araujo, Iris de; Lima, Júlia; Sperança, Marcia Aparecida; Puzer, Luciano; Daffre, Sirlei; Pires, Jose Ricardo Murari; Silva, Fernanda Dias da; "Expressão Recombinante do Peptídeo Antimicrobiano e Quelante de Cobre Microplusina, Contendo Modificações em suas Extremidades Amino- e Carboxi-terminais", p-330-330. In: In Anais do V Simpósio de Bioquímica e Biotecnologia - VSIMBBTEC [=Blucher Biochemistry Proceedings].. São Paulo: Blucher, 2015.
ISSN 23595043, DOI 10.5151/biochem-vsimbbtec-21974