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Xilooligossacarídeos (XOs) são prebióticos de alto valor agregado que podem ser produzidos pela hidrólise da xilana do bagaço de cana-de-açúcar em processo catalisado por xilanases. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a produção de XOs por xilanases livres e imobilizadas a partir de bagaço de cana-de-açúcar. Para isso, a hemicelulose do bagaço foi solubilizada por pré-tratamento hidrotérmico, gerando um licor rico em xilooligômeros de cadeia longa, os quais foram submetidos à hidrólise enzimática por diferentes xilanases (50ºC, 150 UI/gxilana, pH 5,6). Todas as xilanases estudadas apresentaram elevada conversão de xilana em XOs (acima de 90%) com baixa produção de xilose. Xilobiose (X2) foi produzida majoritariamente em todos os casos. A imobilização da enzima NS22036 favoreceu a produção de X2, aumentando de 24,5% para 41,1% dos XOs totais o teor de X2 utilizando sua forma solúvel e imobilizada.