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As actinobactérias são bactérias filamentosas Gram-positivas com grande potencial na produção de diversos metabólitos, como enzimas, compostos antitumorais e compostos antimicrobianos. O desenvolvimento de estudos em bioprospecção é muito importante na busca de novas fontes potenciais para produção de substâncias com ação antimicrobiana (SAMs). Desta forma, o presente trabalho objetivou avaliar o potencial de diversas linhagens de actinobactérias isoladas de diferentes biomas brasileiros na produção de SAMs. Ao todo, 176 linhagens de actinobactérias foram testadas contra diferentes linhagens de bactérias teste (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus MRSA) e leveduras (Cryptococcus neoformans, Candida albicans) com relevância médica. As actinobactérias foram cultivadas em meio Ágar Muller-Hinton por 12 dias a 28ºC e, após esse período, os microrganismos-teste foram inoculados pela técnica cross-streak (antibiose) e incubados a 35ºC por 48 horas. A linhagem AM6-12 apresentou os melhores resultados no teste de antibiose e foi selecionada para produção da SAM por fermentação submersa. A linhagem foi inoculada em frasco cônico (1.000 mL) contendo glicerol-peptona, incubada a 28ºC por 12 dias e após obtenção do sobrenadante, 3 concentrações diferentes (50, 100 e 150 L) do extrato foram aplicados em discos de papel de filtro ( 5 mm). Os discos foram colocados na superfície do meio Ágar Muller-Hinton, inoculado com suspensão dos microrganismos-teste padronizada (0.5 escala McFarland) e incubados a 35ºC por 36h. Após esse período, os halos de inibição foram medidos e o potencial de inibição determinado. Os maiores halos de inibição foram observados para o S. aureus MRSA ( 19 mm) e P. aeruginosas ( 10 mm). Assim, os resultados obtidos sugerem o potencial biotecnológico da linhagem AM6-12 para produção de SAMs por processo fermentativo.