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Atualmente, a elevação demasiada nos preços dos combustíveis fósseis, aliada à sua possível escassez, tem proporcionado uma busca por combustíveis alternativos gerados a partir de biomassa. As fibras da biomassa da cana-de-açúcar são lignocelulósicas, com uma estrutura complexa. A biomassa, então, deve passar por uma etapa de pré-tratamento conhecida como hidrólise, para a desestruturação das fibras. É neste contexto que o presente trabalho foi desenvolvido, estudando a influência de três variáveis na etapa de hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pela aplicação de um planejamento fatorial 23, onde o catalisador (X1), o solvente (X2) e o tempo de reação (X3) foram as variáveis investigadas e a concentração da glicose a resposta obtida. Os resultados encontrados mostram uma influência significativa das variáveis estudadas na concentração da glicose. A melhor combinação das variáveis estudadas ocorreu quando o solvente utilizado foi o etanol, o catalisador o ácido sulfúrico e no maior tempo da reação, obtendo 6 g de glicose/ L de solução.