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O soro lácteo apresenta elevada concentração de lactose e, consequentemente, diversas possibilidades de reaproveitamento e valorização. Nesse sentido, a hidrólise da lactose é um processo promissor para as indústrias alimentícias pois possibilita o desenvolvimento de produtos com baixo teor de lactose ou sem lactose. Há diferentes métodos para a conversão de lactose nos produtos lácteos, sendo a hidrólise enzimática o mais empregado. Entretanto, devido as aplicações de enzimas livres apresentarem limitações, a utilização de enzimas imobilizadas apresenta vantagens, como a reutilização, aumento da estabilidade do biocatalisador e melhoria no processo. O objetivo desse trabalho foi otimizar o processo de imobilização da ?-galactosidase Kluyveromyces lactis por adsorção e ligação cruzada, utilizando como suporte resina de troca iônica Duolite A568. A atividade enzimática no teste com a enzima livre foi de 0,782 e com a enzima imobilizada, sem passar pelo processo de reticulação, foi de 0,520. As atividades foram próximas, demonstrando que o processo adotado para a imobilização foi adequado. Para o estudo da influência da concentração de enzima e do volume de glutaraldeído foi utilizado o planejamento fatorial 22. A variável significativa do modelo foi a concentração de enzima, sendo que a maior atividade foi de 0,0880 U com a maior concentração de 5 mL L-1.